背景
水稻真菌病害多由真菌孢子引起，真菌孢子是一種小型無(wú)性繁殖體，主要通過(guò)空氣傳播。分生孢子越多，傳播范圍越廣，尤其是稻瘟菌（Magnaporthe grisea）和稻綠核菌（Ustilaginoidea virens）。全球每年由稻瘟菌造成的水稻產(chǎn)量損失達(dá)數(shù)億公斤。稻綠核菌一旦侵入籽粒，就會(huì)直接導(dǎo)致水稻空粒率和癟粒率的增加。因此，了解如何在水稻真菌孢子傳播的早期階段快速捕獲和準(zhǔn)確識(shí)別孢子，對(duì)于早期病害預(yù)測(cè)至關(guān)重要。
空氣成分復(fù)雜，微生物種類(lèi)繁多，孢子等微生物懸浮在氣流中，處于不斷碰撞和聚集的狀態(tài)。因此，從空氣中有效分離和捕獲孢子成為孢子檢測(cè)的首要問(wèn)題。與傳統(tǒng)的孢子捕獲方法相比，微流控技術(shù)是一種快速、高通量的檢測(cè)方法，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析、集成化、小型化和低消耗。目前已在生物醫(yī)學(xué)、食品檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域大放異彩。
顯微高光譜成像技術(shù)結(jié)合了高光譜和顯微技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。它可以在細(xì)胞水平上對(duì)微生物進(jìn)行無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，具有快速、無(wú)損的優(yōu)點(diǎn)。它不僅可以采集小目標(biāo)的圖像，還可以同時(shí)采集目標(biāo)區(qū)域的光譜信息。目前已被用于開(kāi)發(fā)真菌生長(zhǎng)模擬模型、花生黃曲霉素檢測(cè)等研究中。
因此，本研究提出了一種基于微高光譜和微流控技術(shù)的水稻真菌孢子檢測(cè)方法。針對(duì)稻瘟菌孢子和稻綠核菌孢子設(shè)計(jì)了微流控芯片，使芯片能夠分離空氣中的其他顆粒，并在相應(yīng)富集區(qū)域采集這兩種類(lèi)型的孢子。結(jié)合顯微高光譜成像技術(shù)對(duì)孢子進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)孢子的光譜特征建立分類(lèi)模型，為水稻真菌孢子的早期檢測(cè)提供了新方法和新思路。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)
江蘇大學(xué)毛罕平教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了如圖1a所示的微流控芯片。該芯片可分為三種結(jié)構(gòu)，每種結(jié)構(gòu)都有相應(yīng)的分離通道和富集區(qū)。一級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為雙入口對(duì)稱(chēng)預(yù)處理通道，其中空氣中的孢子首先通過(guò)入口進(jìn)入一級(jí)結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)鞘狀流道。鞘狀流道的主要功能是將含有孢子的氣流擠壓到微通道中，保證進(jìn)入芯片的孢子在微通道中心形成單一的孢子流陣列。在鞘狀流道之后增加一個(gè)減速通道，以減少附加慣性力對(duì)孢子運(yùn)動(dòng)的影響。通道中的孢子在隨氣流移動(dòng)時(shí)也受到慣性的影響。質(zhì)量和尺寸較小的孢子會(huì)隨著氣流移動(dòng)，進(jìn)入分離通道，到達(dá)結(jié)構(gòu)的下一層進(jìn)行分離；而質(zhì)量和大小較大的孢子由于慣性會(huì)繼續(xù)向原來(lái)的方向移動(dòng)，最終會(huì)沖進(jìn)富集區(qū)。鞘流和分離通道的工作原理分別如圖1b、c所示。
圖1 微流控芯片的二維結(jié)構(gòu)（a）;鞘流工作原理示意圖（b）;分離通道工作原理示意圖（c）
后續(xù)對(duì)微流控芯片數(shù)值進(jìn)行模擬分析。利用COMSOL Multiphysics 6.0多物理場(chǎng)仿真軟件對(duì)微流控芯片的流場(chǎng)和孢子運(yùn)動(dòng)進(jìn)行了數(shù)值模擬，對(duì)芯片參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證和優(yōu)化。為了獲得更好的模擬結(jié)果，模擬中使用5µm顆粒來(lái)表征稻綠核菌孢子，12µm顆粒用來(lái)表征稻瘟菌孢子，25µm顆粒用來(lái)表征空氣中較大的雜質(zhì)，2µm顆粒用來(lái)表征空氣中較小的雜質(zhì)。
本研究采用江蘇雙利合譜公司生產(chǎn)的GaiaMicro系列顯微高光譜成像系統(tǒng)用于孢子高光譜影像的獲取。該系統(tǒng)主要由顯微鏡、V10光柵器件、電荷耦合器件探測(cè)器、數(shù)據(jù)采集模塊和計(jì)算機(jī)組成。有效波長(zhǎng)范圍為400-1000 nm，光譜分辨率為2.8 nm，光譜采樣率為0.7 nm。通過(guò)計(jì)算每個(gè)感興趣區(qū)內(nèi)所有像素的光譜反射率的平均值作為該孢子樣本的光譜數(shù)據(jù)。兩種孢子共獲得300個(gè)光譜數(shù)據(jù)。為避免信息的冗余，文中采用競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)重加權(quán)抽樣（CARS）用于特征的優(yōu)選，并使用支持向量機(jī)（SVM）和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）構(gòu)建最佳孢子分類(lèi)模型。
結(jié)論
為了找到隱藏參數(shù)的最佳值，并確保每個(gè)富集區(qū)域具有最高的富集效率，采用不同范圍的值對(duì)隱藏參數(shù)進(jìn)行模擬。發(fā)現(xiàn)當(dāng)通道角θ2為45度、寬度W1和W2均為1800 μm時(shí)，顆粒富集效率最高。當(dāng)W4為1000 μm、W3/W4為1.2以及W6為500 μm、W5/W6為1.6時(shí)分別對(duì)12 μm和5 μm的顆粒富集效率最高。
圖2a-d為本研究設(shè)計(jì)的微流控芯片對(duì)不同粒徑顆粒富集效果的模擬。粒徑大于或等于18 µm的顆粒由于慣性作用會(huì)沖進(jìn)富集區(qū)1a和1b，粒徑小于18 µm的顆粒會(huì)隨著氣流進(jìn)入二級(jí)結(jié)構(gòu)，粒徑在8 µm ~ 17 µm的顆粒會(huì)沖進(jìn)富集區(qū)2。第三階段的分離和富集結(jié)構(gòu)與第二階段相似，粒徑在4 μm ~ 7 μm之間的顆粒進(jìn)入富集區(qū)3，粒徑小于4 μm的顆粒直接從出口排出。微流控芯片通道的速度分布圖如圖5e所示，微流控芯片通道的壓力分布強(qiáng)度圖如圖5f所示。
圖2 富集區(qū)1a和1b為25 µm顆粒（a）;富集區(qū)2為12 µm顆粒（b）；富集區(qū)3為5 µm顆粒（c）；從出口排出2 µm顆粒（d）；微流控芯片通道速度分布（e）；微流控芯片壓力分布（d）
圖3為孢子富集實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。將制備好的孢子懸浮液放置在氣溶膠發(fā)生器中，空氣經(jīng)氣泵壓縮后送入氣溶膠發(fā)生器，產(chǎn)生生物氣溶膠流。氣溶膠流進(jìn)入擴(kuò)散干燥器以除去水分。烘干機(jī)后連接流量計(jì)，將流速設(shè)置為12.5 mL/min，與芯片模擬中的數(shù)值相同。同時(shí)，每個(gè)鞘流口分別連接另一個(gè)微流量計(jì)，并設(shè)定鞘流口流量為2.5 mL/min。最后的氣溶膠流進(jìn)入微流控芯片的通道以分離和富集孢子。打開(kāi)氣泵2 min后，孢子富集實(shí)驗(yàn)完成。富集完成后，用鑷子夾住PDMS膜，緩慢取出。去除PDMS層的微流控芯片放置在顯微鏡下進(jìn)行直接觀察。
圖3 孢子富集實(shí)驗(yàn)平臺(tái)
圖4展示了富集區(qū)2和富集區(qū)3的微高光譜影像?？梢园l(fā)現(xiàn)仍有少量極小顆粒附著在稻瘟菌孢子上一起進(jìn)入富集區(qū)，但本實(shí)驗(yàn)平臺(tái)已具有良好的凈化效果。同時(shí)稻綠核菌孢子在富集區(qū)分布較為均勻。最終，本研究設(shè)計(jì)的微流控芯片對(duì)稻瘟菌孢子和稻綠核菌孢子的實(shí)際富集效率分別為82.67%和80.70%。
圖4 稻瘟菌孢子富集結(jié)果（a）；稻綠核菌孢子富集結(jié)果（b）
本研究使用CARS算法進(jìn)行特征優(yōu)選（圖5）。隨著CARS算法迭代次數(shù)的增加，總體上保留的波段數(shù)量在不斷減少，但減少的速度由快變慢，這是由于CARS算法在特征波段篩選過(guò)程中從粗篩選到細(xì)篩選的變化。從RMSECV的變化趨勢(shì)可以看出，隨著樣本數(shù)量的增加，RMSECV有減小的趨勢(shì)。當(dāng)樣本數(shù)量為6個(gè)時(shí)，REMSECV最小，所選擇的特征子集最優(yōu)。最終選取了34個(gè)特征波長(zhǎng)，占總波段的5.67%。
圖5 CARS特征篩選結(jié)果
表1和表2分別展示了不同模型的分類(lèi)結(jié)果以及分類(lèi)指標(biāo)結(jié)果。以CARS篩選后的波段為變量的分類(lèi)模型優(yōu)于以全波段為變量的分類(lèi)模型。通過(guò)比較CARS-SVM和CARS-CNN分類(lèi)模型，發(fā)現(xiàn)兩種模型對(duì)稻瘟菌孢子的分類(lèi)結(jié)果相似。而CARS-CNN模型對(duì)于稻綠核菌孢子的分類(lèi)結(jié)果中，其二級(jí)指標(biāo)中的準(zhǔn)確率、精確率、召回率和特異性分別為0.960、0.950、0.970和0.950，三級(jí)指標(biāo)的F1得分為0.960，遠(yuǎn)高于CARS-SVM分類(lèi)模型。F1得分越接近1，說(shuō)明分類(lèi)效果越好。因此，CARS-CNN分類(lèi)模型在稻綠核菌孢子分類(lèi)中更有優(yōu)勢(shì)。
表1 不同模型的分類(lèi)結(jié)果
表2 不同模型分類(lèi)指標(biāo)結(jié)果
作者信息
毛罕平，博士，江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)工程學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師。
主要研究方向：現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)及環(huán)境自動(dòng)控制技術(shù)、智能化農(nóng)業(yè)裝備技術(shù)、生物信息探測(cè)與傳感技術(shù)、移栽機(jī)械。
參考文獻(xiàn)：
Zhang, X.D., Song, H.J., Wang, Y.F., Hu, L., Wang, P., & Mao, H.P. (2023). Detection of Rice Fungal Spores Based on Micro- Hyperspectral and Microfluidic Techniques. Biosensors (Basel), 13.
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